Įžanga
Laboratorinių tyrimų medžiagų aprašymuose dažnai galima pamatyti tokius teiginius kaip „≥99 % purity by HPLC“ arba „HPLC purity: 99.2 %“.
Tačiau ką iš tikrųjų reiškia šis skaičius?
HPLC yra vienas plačiausiai naudojamų chromatografinių analizės metodų, leidžiančių atskirti ir analizuoti mėginyje esančius komponentus. Peptidų tyrimuose HPLC gali būti naudojama vertinant mėginio sudėtį ir pagrindinio komponento santykinį grynumą.
Vis dėlto svarbu suprasti, kad užrašas „99 % HPLC grynumas“ nėra tas pats, kas teiginys „produktas yra 99 % visais įmanomais aspektais grynas“.
Šiame straipsnyje paaiškiname, kas yra HPLC, kaip atliekama analizė ir kaip teisingai interpretuoti jos rezultatus.
Kas yra HPLC?
HPLC yra angliško termino High-Performance Liquid Chromatography santrumpa. Lietuviškai šis metodas vadinamas aukšto efektyvumo skysčių chromatografija.
Tai analitinis metodas, naudojamas mišinyje esančioms medžiagoms atskirti, identifikuoti arba kiekybiškai vertinti, priklausomai nuo konkretaus metodo ir tyrimo tikslo.
Supaprastintai galima įsivaizduoti, kad mėginys juda per chromatografinę sistemą, kurioje skirtingi jo komponentai dėl savo fizikinių ir cheminių savybių sąveikauja nevienodai.
Dėl to jie gali būti atskiriami ir detektuojami skirtingu laiku.
Kaip veikia HPLC?
HPLC sistemoje skystoji judrioji fazė aukštu slėgiu juda per kolonėlę, kurioje yra stacionarioji fazė.
Į sistemą įleidžiamas tiriamas mėginys.
Skirtingos mėginyje esančios medžiagos su chromatografine sistema sąveikauja nevienodai, todėl per kolonėlę juda skirtingu greičiu.
Kai atskirti komponentai pasiekia detektorių, registruojamas signalas.
Galutinis rezultatas dažnai pateikiamas chromatogramos pavidalu.
Kas yra chromatograma?
Chromatograma – grafinis chromatografinės analizės rezultato atvaizdavimas.
Joje paprastai matomos viena ar daugiau smailių, vadinamų peaks.
Kiekviena smailė atitinka tam tikru laiku detektoriaus užregistruotą signalą.
Laikas, per kurį konkretus komponentas pasiekia detektorių, vadinamas retencijos laiku.
Priklausomai nuo naudojamos metodikos, chromatogramos smailių plotai gali būti naudojami mėginio komponentų santykiniam kiekiui įvertinti.
Ką reiškia 99 % HPLC grynumas?
Tarkime, laboratorijos ataskaitoje nurodyta:
Purity by HPLC: 99.1 %
Supaprastintai tai reiškia, kad pagal konkrečias tos HPLC analizės sąlygas pagrindiniam nustatytam komponentui priskirtas signalas sudarė maždaug 99,1 % atitinkamai apskaičiuoto chromatografinio signalo.
Tačiau šį rezultatą reikia vertinti konkretaus metodo kontekste.
HPLC rezultatas priklauso nuo daugelio parametrų, įskaitant naudojamą kolonėlę, judriąją fazę, gradientą, detekcijos būdą, mėginio paruošimą ir rezultatų apskaičiavimo metodiką.
Todėl skaičius 99 % neturėtų būti vertinamas atskirai nuo informacijos apie tai, kaip analizė buvo atlikta.
Ar 99 % HPLC grynumas reiškia, kad mėginyje yra 99 % peptido pagal masę?
Nebūtinai.
Tai viena dažniausių HPLC rezultatų interpretavimo klaidų.
Chromatografinio grynumo procentas ir absoliuti konkrečios medžiagos masė mėginyje yra skirtingos sąvokos.
HPLC analizė gali parodyti, kokią santykinę chromatografinio signalo dalį sudaro pagrindinis komponentas pagal taikytą metodą.
Tačiau vien šio rezultato nepakanka automatiškai teigti, kad, pavyzdžiui, 10 mg buteliuke yra lygiai 9,9 mg konkretaus peptido.
Norint nustatyti faktinį medžiagos kiekį, reikalinga tam pritaikyta kiekybinė analizė.
Ar HPLC patvirtina medžiagos tapatybę?
Vien chromatografinio grynumo skaičiaus nereikėtų automatiškai laikyti visapusišku medžiagos tapatybės patvirtinimu.
Grynumas ir tapatybė yra skirtingi analitiniai klausimai.
HPLC gali suteikti labai vertingos informacijos apie mėginio chromatografinę sudėtį, tačiau medžiagos tapatybei patvirtinti, priklausomai nuo tyrimo tikslo, gali būti naudojami ir papildomi analitiniai metodai.
Vienas jų – masių spektrometrija (MS), kuri gali suteikti informaciją apie analizuojamos medžiagos molekulinę masę.
Todėl laboratorinės dokumentacijos vertinimas neturėtų apsiriboti vien dideliu „99 %“ skaičiumi.
HPLC ir masių spektrometrija – kuo skiriasi?
Supaprastintai:
HPLC pirmiausia yra chromatografinio atskyrimo metodas.
MS (Mass Spectrometry) analizuoja jonus pagal jų masės ir krūvio santykį ir gali suteikti informaciją, naudingą medžiagos molekulinei charakteristikai bei identifikacijai.
Šie metodai gali būti naudojami atskirai arba derinami, priklausomai nuo laboratorinio tyrimo tikslo.
Todėl laboratoriniame dokumente verta patikrinti ne tik galutinį grynumo procentą, bet ir kokie analizės metodai buvo naudoti.
Ar HPLC nustato visas galimas priemaišas?
Ne.
HPLC analizė nustato tai, ką konkrečiomis metodo sąlygomis galima atskirti ir aptikti naudojama sistema.
Tai nereiškia, kad vienas HPLC tyrimas automatiškai nustato visas įmanomas priemaišas ar kitus produkto kokybės parametrus.
Pavyzdžiui, vien HPLC grynumo rezultatas savaime nepatvirtina:
– sterilumo;
– endotoksinų kiekio;
– mikrobiologinės kokybės;
– sunkiųjų metalų nebuvimo;
– likutinių tirpiklių nebuvimo;
– absoliutaus medžiagos kiekio;
– visų galimų priemaišų nebuvimo;
– produkto tinkamumo vartoti žmonėms.
Šiems parametrams vertinti reikalingi atitinkami atskiri laboratoriniai metodai.
Kodėl svarbu žinoti laboratoriją ir mėginio partiją?
HPLC rezultatas apibūdina konkretų laboratorijai pateiktą mėginį.
Todėl vertinant laboratorinės analizės dokumentaciją svarbu patikrinti, ar galima nustatyti:
– laboratoriją;
– tirtą medžiagą;
– mėginio arba partijos numerį;
– tyrimo datą;
– naudotą metodą;
– gautą rezultatą.
Jeigu produktas turi partijos numerį, jį verta palyginti su laboratorinėje dokumentacijoje pateikta mėginio arba partijos identifikacija.
Tai padeda suprasti, ar pateikiamas laboratorinis rezultatas yra susietas su konkrečia produkto partija.
HPLC ir COA – kuo jie skiriasi?
Šie du terminai nėra sinonimai.
HPLC yra laboratorinės analizės metodas.
COA (Certificate of Analysis) – analizės sertifikatas arba dokumentas, kuriame pateikiami atliktų laboratorinių tyrimų rezultatai.
Todėl HPLC rezultatas gali būti viena iš COA dalių.
Pavyzdžiui, COA gali būti nurodyta:
Test: Purity
Method: HPLC
Result: 99.2 %
Tačiau tame pačiame COA gali būti pateikti ir kitais metodais nustatyti parametrai.
Kaip vertinti HPLC rezultatą?
Matant HPLC laboratorinį rezultatą verta užduoti bent kelis klausimus:
1. Kas buvo tirta?
Ar aiškiai nurodytas mėginys ir tiriama medžiaga?
2. Kokia partija buvo tirta?
Ar laboratorinis dokumentas gali būti susietas su konkrečiu produktu?
3. Kas atliko analizę?
Ar galima identifikuoti laboratoriją?
4. Koks metodas buvo naudojamas?
Ar dokumente aiškiai nurodyta HPLC analizė ir kita reikšminga metodinė informacija?
5. Koks rezultatas?
Koks chromatografinis grynumas buvo nustatytas?
6. Kas nebuvo tirta?
Kokių išvadų iš šio konkretaus rezultato daryti negalima?
Paskutinis klausimas yra ne mažiau svarbus už patį grynumo procentą.
HPLC peptidų tyrimuose
HPLC plačiai naudojama peptidų analizėje, nes chromatografiniai metodai leidžia atskirti ir analizuoti skirtingus mėginio komponentus.
Tačiau laboratorinio rezultato vertė priklauso ne tik nuo pateikto procento, bet ir nuo tinkamai parinkto bei atlikto metodo.
Todėl vertinant laboratoriniams tyrimams skirtų peptidų dokumentaciją naudinga kartu vertinti HPLC rezultatus, medžiagos identifikaciją, partijos informaciją ir kitus atliktus tyrimus.
Dažniausiai užduodami klausimai apie HPLC
Ką reiškia HPLC?
HPLC reiškia „High-Performance Liquid Chromatography“ – aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją. Tai chromatografinės analizės metodas, naudojamas mišinio komponentams atskirti ir analizuoti.
Ką reiškia 99 % HPLC grynumas?
Tai pagal konkretaus HPLC tyrimo metodiką apskaičiuotas chromatografinio grynumo rezultatas. Jį reikia interpretuoti atsižvelgiant į naudotą metodą ir tyrimo sąlygas.
Ar 99 % HPLC reiškia, kad 10 mg produkto yra 9,9 mg peptido?
Nebūtinai. Chromatografinis grynumas nėra automatiškai tapatus absoliučiam konkrečios medžiagos kiekiui mėginyje.
Ar HPLC parodo, kokia medžiaga yra mėginyje?
HPLC suteikia informaciją apie mėginio chromatografinį profilį. Medžiagos tapatybei patvirtinti, priklausomai nuo tyrimo tikslo, gali būti naudojami papildomi metodai, pavyzdžiui, masių spektrometrija.
Ar HPLC patvirtina produkto sterilumą?
Ne. Sterilumas yra atskiras kokybės parametras, kuriam nustatyti reikalingi atitinkami mikrobiologiniai tyrimai.
Ar HPLC ir COA yra tas pats?
Ne. HPLC yra laboratorinės analizės metodas, o COA – dokumentas, kuriame gali būti pateiktas HPLC ir kitų laboratorinių tyrimų rezultatas.
Kaip suprasti laboratorinius rezultatus?
Vertinant laboratorinių tyrimų medžiagą nereikėtų apsiriboti vien didžiausiu COA nurodytu procentu.
Daug informatyviau kartu vertinti:
medžiagos identifikaciją → partijos numerį → laboratoriją → analizės metodą → rezultatą → tyrimo ribas.
Toks požiūris leidžia tiksliau suprasti, ką laboratorinis rezultatas iš tikrųjų patvirtina ir kokių išvadų iš jo daryti negalima.
Peptilab skiltyje „Peptidų tyrimai ir informacija“ pateikiame edukacinę informaciją apie peptidus, HPLC, COA ir kitus laboratorinės analizės aspektus.
Svarbu: pateikiama informacija yra edukacinio ir mokslinio pobūdžio. „Research Use Only“ pažymėtos tyrimų medžiagos nėra skirtos žmonių ar gyvūnų vartojimui, diagnostikai, gydymui ar ligų profilaktikai.
Taip pat skaitykite
Kas yra peptidai? Peptidų struktūra, savybės ir moksliniai tyrimai
Kas yra COA ir kaip suprasti analizės sertifikatą?
Kas yra MOTS-c? Mitochondrijų peptidas ir jo moksliniai tyrimai